پزشکی بازساختی و سلول‌های بنیادی

یک سیستم ویرایش ژنوم جدید، که در مگس سرکه توسعه یافته است، ترمیم سوماتیک کارآمدی را با استفاده از توالی‌های دست نخورده از کروموزوم همولوگ انجام می‌دهد. محققان به فرآیندی که از nickase استفاده می‌کند، به عنوان تعمیر همولوگ با قالب کروموزوم (HTR) اشاره می‌کنند.

ترمیم شکست‌های دو رشته‌ای (DSBها) در سلول‌های سوماتیک، عموماً با اتصال انتهایی غیر همولوگ مستعد خطا انجام می‌شود. فنوتیپ‌های ترمیم ناشی از nickase (در مقابل Cas9) توصیف شده‌اند که هم با زمان‌بندی رشد (به ترتیب اواخر در مقابل مراحل اولیه) و هم با تولید رویدادهای جهش‌زای نامطلوب (نادر در مقابل مکرر) متمایز می‌شوند.

پژوهشگران خاطرنشان می‌کنند که HTR با واسطه nickase نشان‌دهنده یک مکانیسم کارآمد و پیش‌بینی نشده برای اصلاح آللی با کاربردهای بالقوه گسترده در زمینه ویرایش ژن است.

این پژوهش در Science Advances در مقاله «تبدیل آللی ناشی از Cas9/Nickase توسط ترمیم الگوی کروموزوم همولوگ در سلول‌های سوماتیک مگس سرکه» منتشر شده است.

در بسیاری از موارد، کسانی که از اختلالات ژنتیکی رنج می‌برند، دارای جهش‌های مشخصی در دو نسخه ژن هستند. بنابراین، جهش در یک کروموزوم دارای یک توالی عملکردی در کروموزوم دیگر خواهد بود. محققان از ابزارهای ویرایش ژنتیکی CRISPR برای بهره‌برداری از این واقعیت استفاده کردند.

دکتر آنابل گیچارد، دانشمند پروژه در آزمایشگاه اتان بیر در دانشگاه کالیفرنیا در سانتا کروز، گفت: «نوع سالم می‌تواند توسط ماشین‌های تعمیر سلول برای اصلاح جهش معیوب پس از برش DNA جهش‌یافته استفاده شود. قابل توجه است که این امر می‌تواند با استفاده از یک برش ساده بی‌ضرر به‌طور مؤثرتری به دست آید.»

محققان از جهش یافته‌های رنگ چشم برای تجسم ترمیم همولوگ با قالب کروموزوم یا HTR استفاده کردند. این جهش‌یافته‌ها در ابتدا دارای چشم‌های کاملاً سفید بودند. اما زمانی که همان مگس‌ها یک RNA راهنما به اضافه Cas9 را بیان کردند، لکه‌های قرمز بزرگی را روی چشمان خود نشان دادند، نشانه‌ای از این که دستگاه ترمیم DNA سلول با استفاده از DNA عملکردی کروموزوم دیگر موفق به معکوس کردن جهش شده است.

آنها سپس سیستم جدید خود را با nickase هایی آزمایش کردند که به جای هر دو، یک رشته از DNA را جدا می‌کنند.  nickaseهمچنین باعث ترمیم سطح بالایی رنگ چشم قرمز تقریباً همتراز با مگس‌های نوع وحشی شد. آنها دریافتند که تبدیل آللی با واسطه HTR در مکان سفید در پاسخ به SSBهای ناشی از nickaseهای D10A یا H840A مشتق از Cas9 نسبت به DSBهای القا شده توسط Cas9 کاملا فعال (30-20٪) کارآمدتر بود (40-65٪).

ویرایش ژن ترمیمی با استفاده از توالی‌هایی از کروموزوم همتا: آنزیم استاندارد CRISPR Cas9 توانایی انجام تعمیرات را ارائه می‌دهد، اما به طور بالقوه منجر به جهش‌های ناخواسته در محل مورد نظر و احتمالاً در جاهای دیگر ژنوم (سمت چپ) می‌شود. در مقابل، آنزیم nickase منجر به تصحیح ژن کارآمدتر و عدم ایجاد رویدادهای جهش‌زا می‌شود (سمت راست). سیتارا روی، دارای دکترا و فوق دکترا در آزمایشگاه Bier در UCSD، گفت: «نمی‌توانستم باور کنم که nickase چقدر خوب کار می‌کند - کاملاً غیرقابل پیش‌بینی بود». محققان خاطرنشان کردند که تطبیق‌پذیری سیستم جدید می‌تواند به عنوان الگویی برای رفع جهش‌های ژنتیکی در پستانداران باشد.

گیچارد می‌گوید: «ما هنوز نمی‌دانیم این فرآیند چگونه به سلول‌های انسانی ترجمه می‌شود و آیا می‌توانیم آن را برای هر ژنی اعمال کنیم یا خیر. "ممکن است برای به دست آوردن HTR کارآمد برای جهش‌های بیماری زا که توسط کروموزوم‌های انسانی منتقل می‌شوند، برخی تنظیمات لازم باشد."

پژوهش جدید دستاوردهای قبلی گروه در ویرایش دقیق را با «درایوهای آللیک» گسترش می‌دهد، که اصول محرک‌های ژنی را با یک RNA راهنما گسترش می‌دهد و سیستم CRISPR را هدایت می‌کند تا گونه‌های نامطلوب یک ژن را قطع کند و آن‌ها را با نسخه ترجیحی از ژن جایگزین کند.

یکی از ویژگی‌های کلیدی تحقیقات این تیم این است که سیستم مبتنی بر nickase آن‌ها نسبت به ویرایش‌های سنتی CRISPR مبتنی بر Cas9، جهش‌های درون و خارج هدف بسیار کمتری ایجاد می‌کند. آنها همچنین خاطرنشان می‌کنند که تحویل آهسته و مداوم اجزای nickase در طول چند روز ممکن است سودمندتر از تحویل یکباره باشد.

دکتر اتان بیر، استاد بخش زیست شناسی سلولی و رشدی در UCSD گفت: «یکی دیگر از مزایای قابل توجه این رویکرد سادگی آن است. بر خلاف Cas9 که شکستگی کامل DNA را ایجاد می‌کند و اغلب با جهش همراه است، به اجزای بسیار کمی متکی است و نیک‌های DNA «نرم» هستند».

روی خاطرنشان می‌کند: «اگر بتوان فرکانس چنین رویدادهایی را با ترویج جفت‌سازی بین همولوژیکی یا با بهینه‌سازی فرآیندهای ترمیم خاص افزایش داد، چنین استراتژی‌هایی می‌توانند برای اصلاح بسیاری از جهش‌های غالب یا ترانس هتروزیگوت استفاده شوند.»

https://www.genengnews.com/topics/genome-editing/new-soft-crispr-nicking-system-simple-efficient-and-safe/